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Real-time qPCR淺談---熒光定量PCR是這樣子的

  前言

  由于Real-time qPCR的眾多優點,現在已經是生命科學領域的一項常規技術。越來越多的研究文章中涉及RT-PCR的實驗,也基本上被real-time qPCR所代替。由于real-time aPCR輸出的數據不同于常規的PCR電泳檢測,很多沒有做過real-time qPCR的研究者常常感到高深莫測,不知從何入手;甚至一些做過幾次實驗的研究者也會對數據處理分析感到迷惑,不知所措。本文就從real-time qPCR的發展史說起,包括real-time qPCR的原理,實驗設計,實際操作注意事項,數據分析,常見問題解答五個方面,一點一點地對real-time qPCR做個比較詳細的介紹,讓您對real-time qPCR不再感到神秘。奧,熒光定量PCR原來是這樣子的 !

  一、Real-time qPCR發展史

  Real-time qPCR就是在PCR擴增過程中,通過熒光信號,對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期,模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系,所以成為定量的依據。由于常規的PCR的缺點,real-time qPCR由于其操作簡便,靈敏度高,重復性好等優點發展非常迅速。設在已經涉及到生命科學研究的各個領域,比如基因的差異表達分析,SNP檢測,等位基因的檢測,藥物開發,臨床診斷,轉基因研究等。

  在Real-time qPCR技術的發展過程中,定量PCR儀的發展起了至關重要的作用。1995年,美國PE公司(已經并入Invitrogen公司)成功研制了Taqman®技術,1996年推出了首臺熒光定量PCR檢測系統,通過檢測每個循環的熒光強度,通過Ct值進行數據分析。從而熒光定量PCR獲得廣泛應用。現在的定量PCR儀有ABI 7000、7300、7500,7700、7900HT、StepOnePlus TM、StepOne TM、PRISM® StepOne TM系列;BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5®、MyiQ®、MJ Research Chromo4 TM Opticon系列;Stratagene Mx TM系列;Roche LightCycler®系列;Eppendorf Masercycler®;Corbett Rotor-Gene TM;Cepheid SmartCycler® 和BIOER 的LineGene系列(考慮到其是日資子公司,還是不并入國內企業吧!)。

  隨國內生命科學的快速發展,科研水平不斷提高,發高水平文章已不再是新鮮事。與其同時,國內公司經過長期不懈的努力,也有自主研發的real-time PCR儀器生產比如西安天隆科技公司的TL系列儀器。

  二、Real-time qPCR概述

  1. Real-time qPCR原理

  實時PCR就是在PCR擴增過程中,通過熒光信號,對PCR進程進行實時檢測。一般來講,定量PCR儀包括:實時熒光定量PCR儀主要由樣品載臺、基因擴增熱循環組件、微量熒光檢測光學系統、微電路控制系統、計算機及應用軟件組成。其中基因擴增熱循環組件工作原理與傳統基因擴增儀大致相同,不同廠家不同型號的產品分別采用空氣加熱、壓縮機制冷、半導體加熱制冷等工作方式。獨特是這個微量熒光檢測系統。有由熒光激發光學部件、微量熒光檢測部件、光路、控制系統組成。常用的熒光激發方式有兩種:鹵鎢燈和LED;熒光檢測元件常用兩種方式:光電倍增管和冷光CCD攝像機,光單色元件有濾光片和光柵。在實時PCR擴增過程中,熒光信號被收集,轉化為成為擴增和熔解曲線。具體數據就是基線,熒光閾值和Ct值。

  2. Real-time qPCR的數學原理

  也就是說為什么Ct值跟初始模板的量成正比?首先來看一個real-time qPCR中的重要參數(具體的后面會講到)Ct值(Ct value),閾值(threshold),和基線(baseline)。一般來講,第3-15個循環的熒光值就是基線,是由于測量的偶然誤差引起的。閾值一般是基線的標準偏差的是10倍。在實際操作中也可以手動調節,位于指數期就可以。Ct值就是熒光值達到閾值時候的PCR循環次數。所以是一個沒有單位的參數。

  那么為什么說Ct值跟初始模板的量程正比呢?詳細的這里不做介紹,我們只做簡單分析。

  從線性方程上看,斜率(slope)為-1/lg(1+E),所以E=10-1/slope-1。如果從標準曲線上得到斜率(-3.3),就可以算出擴增效率(0.99)。一般來講PCR擴增效率在90%-110%都是可以用于數據分析的。效率低于100%,是由于PCR反應中存在抑制因素;而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。

  3. Real-time qPCR的種類

  根據real-time qPCR的化學發光原理可以分為2大類:一類為探針類 包括TaqMan®探針和 分子信標,利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加。;一類為非探針類,其中包括如SYBR® Green I或者特殊設計的引物(如LUX® Primers) 通過熒光染料來只是產物的增加。

  3.1 Taqman® 探針法

  Taqman®探針是最早用于定量的方法。就在PCR擴增時加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸:5’端標記一個報告熒光基團,3’端標記一個淬滅熒光基團。探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收,也就是FRET反應;PCR擴增時,Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析,又可分析基因突變(SNP),有望成為基因診斷和個體化用藥分析的首選技術平臺。

  3.2 分子信標法

  分子信標:一種在靶DNA不存在時形成莖環結構的雙標記寡核苷酸探針。在此發夾結構中,位于分子一端的熒光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。分子信標的莖環結構中,環一般為15-30個核苷酸長,并與目標序列互補;莖一般5-7個核苷酸長,并相互配對形成莖的結構。熒光基團連接在莖臂的一端,而淬滅劑則連接于另一端。分子信標必須非常仔細的設計,以致于在復性溫度下,模板不存在時形成莖環結構,模板存在時則與模板配對。與模板配對后,分子信標的構象改變使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發時,它發出自身波長的光子。

  3.3 SYBR® Green法

  SYBR® Green I是一種結合于小溝中的雙鏈DNA結合染料,與雙鏈DNA結合后,其熒光大大增強。這一性質使其用于擴增產物的檢測非常理想。SYBR® GreenI的最大吸收波長約為497nm ,發射波長最大約為520nm。在PCR反應體系中,加入過量 SYBR® Green熒光染料,SYBR® Green熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后,發射熒光信號,而不摻入鏈中的 SYBR® Green 染料分子不會發射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。

  3.4 LUX® primers法

  LUX® (light upon extention) 引物是利用熒光標記的引物實現定量的一項新技術。目標特異的引物對中的一個引物 3’端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下,該引物自身配對,形成發夾結構,使熒光淬滅。在有目標片斷的時候,引物與模板配對,發夾結構打開,產生特異的熒光信號。

  4. Real-time qPCR和常規PCR的區別

  Ø 實時檢測(在對數擴增時期)而不是終點檢測

  Ø 敏感性高

  Ø 需要樣品少

  Ø 特異性高

  Ø 精確定量

  三、Real-time qPCR實驗設計

  實驗設計其實比實驗本身更重要!好的實驗設計可以事半功倍,節省時間!尤其做生物實驗,一定要查詢盡可能完全的相關資料,整理好思路,設計好實驗路線。當然實驗過程中出現各種各樣的變化,但有足夠多的背景知識,就可以分析原因,才有可能創新。對于一個real-time qPCR而言,首先就是實驗材料的處理和準備;然后引物設計,這步至關重要,好的引物是實驗本身成功的50%;進行實驗和數據分析(這一部分單獨說明)。

  1. 實驗材料的處理和準備

  以最基本的基因表達差異分析為例。實驗材料分為對照組(CON)和處理組(TRT)。組內要有生物重復,可以數據分析此處理是否有統計意義。在材料收集過程中,盡量避免RNA的降解(尤其對于絕對定量的樣品)。一般傳統的收集材料的方法是樣品采集立刻液氮速凍,然后迅速轉移到超低溫冰箱保存,但這種方法攜帶不方便,由于對于異地取材。現在新技術的發展,也有一些非液氮類的樣品儲存液,比如RNAlater等。

  2. 引物設計

  一般real-time PCR 引物的設計遵循下面一些原則:

  Ø 擴增產物長度在80-150bp。

  Ø 引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性。

  Ø 產物不能形成二級結構。

  Ø 產物長度一般在15~30堿基之間。

  Ø G+C含量在40%~60%之間。

  Ø 堿基要隨機分布。

  Ø 引物自身不能有連續4個堿基的互補。

  Ø 引物之間不能有連續4個堿基的互補。

  Ø 引物5’端可以修飾。

  Ø 引物3’端不可修飾。

  Ø 引物3’端要避開密碼子的第3位。

  Taqman® 探針的設計稍有不同,一般有公司設計合成。遵循下面一下原則:

  Ø 盡量靠在上游引物;

  Ø 長度30-45bp,Tm比引物高至少 5℃;

  Ø 5’端不要是G,G會有淬滅作用,影響定量

  四、Real-time qPCR操作過程

  在抽提RNA過程中任一環節的不正確操作都可能導致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很難完全抑制,預防其污染是十分必要的。在實際的操作中應遵循下面一些原則:

  1. 全程佩戴一次性手套。皮膚經常帶有細菌和霉菌,可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來源。培養良好的微生物實驗操作習慣預防微生物污染。

  2. 使用滅菌的,一次性的塑料器皿和自動吸管抽提RNA,避免使用公共儀器所導致的RNA酶交叉污染。例如,使用RNA探針的實驗室可能用RNA酶A或T1來降低濾紙上的背景,因而某些非一次性的物品(如自動吸管)可能富含RNA酶。

  3. 在提取裂解液中,RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對樣品的后續操作會要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘,用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。

  當然,這些也不是絕對的要求。如果是操作熟練。完全可以用初次開封的離心管和槍頭,新過濾的超純水,進行RNA的提取。如果是進行一步法real-time qPCR(以總RNA或mRNA為模板),就直接按照說明書在MasterMix里加入RNA和引物就可以放在儀器上進行反應。如果是兩步法(以cDNA為模板)。反轉錄一般取1μg或者2μg的總RNA,20μl或者50μl的反應體系,按說明書操作即可。

  1. Mix配制

  一般來講,進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR靈敏度高,所以每個樣品至少要做3個平行孔,以防在后面的數據分析中,由于Ct相差較多或者SD太大,無法進行統計分析。通常來講,反應體系的引物終濃度為100-400mM;模板如果是總RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情況下是1μl或者1μl的10倍稀釋液,要根據目的基因的表達豐度進行調整。當然這些都是經驗值,在操作過程中,還需要根據所用MasterMix,模板和引物的不同就行優化,達到一個最佳反應體系。在反應體系配置過程中,有下面幾點需要注意:

  1. MasterMix不要反復凍融,如果經常使用,最好溶解后放在4度。

  2. 更多的配制Mix進行,減少加樣誤差。最好能在冰上操作。

  3. 每管或每孔都要換新槍頭!不要連續用同一個槍頭加樣!

  4. 所有成分加完后,離心去除氣泡。

  5. 每個樣品至少3個平行孔。

  說到反應體系的配制,不得不說到參比或者校正染料(reference dye,passive dye)。常用的是ROXTM(現在已經是ABI的注冊商標了!)或者其他染料,只要不影響檢測PCR產物的熒光值就可以。參比染料的作用是標準化熒光定量反應中的非PCR震蕩,校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差,提供一個穩定的基線。現在很多公司已經把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里。如果反應曲線良好或已經優化好反應體系,也可以不加ROXTM染料校正。比如Bio-RAD的系列儀器就不需要。

  通常來講,real-time qPCR的反應程序不需要像常規的PCR那樣,要變性、退火、延伸3步。由于其產物長度在80-150bp之間,所以只需要變性和退火就可以了。SYBR® Green等染料法,最好在PCR擴增程序結束后,加一個溶解程序,來形成溶解曲線,判斷PCR產物的特異性擴增。而溶解程序,儀器都有默認設置,或稍有不同,但都是一個在產物進行溶解時候,進行熒光信號的收集。

  2. 儀器設置

  所有儀器的操作都基本一致。設置的時候包括反應板設置(plate setup)和程序設置(program setup)。我們以ABI StepOne為例,詳細看一下反應設置:

  需要注意一點ABI儀器的需要加ROX參比染料的,默認的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面;也有的是單獨分開。要根據不同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。

  設置好之后,就可以把配置好的PCR管放進儀器,點擊RUN !

  五、Real-time qPCR數據分析

  1. Real-time qPCR常見參數

  Ø 基線(baseline)

  通常是3-15個循環的熒光信號

  同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線

  Ø 閾值(threshold)

  自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍

  手動設置:置于指數擴增期,剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。

  同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值,但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。

  Ø Ct值 :與起始濃度的對數成線性關系。

  分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。

  Ø Rn(Normalized reporter)是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光發射強度的比值。

  Ø △Rn:△Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結果(△Rn = Rn –基線)。

  2. 影響Ct值的關鍵因素

  Ø 模板濃度

  模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內,使Ct在15-35之間。

  Ø 反應液成分的影響

  任何分子的熒光發射都受環境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。

  Ø PCR反應的效率

  PCR反應的效率也會影響CT值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增,與PCR擴增效率高的條件下相比,可能會所產生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決于實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來,反應效率在90-110%之間都是可以接受的。

  3. 如何評估實時定量PCR反應的效果

  Ø PCR擴增效率:為了正確地評估PCR擴增效率,至少需要做3次平行重復,至少做5個數量級倍數(5 logs)連續梯度稀釋模板濃度。

  Ø R2值:另一個評估PCR效率的關鍵參數是相關系數R2,它是說明兩個數值之間相關程度的統計學術語。如果R2等于1,那么你可以用Y值(Ct)來準確預測X值(量)。如果R2等于0,你就不能通過Y值來預測X值。R2值大于0.99時,兩個數值之間相關的可信度很好。

  Ø 精確度: 標準偏差(standard deviation,偏差的平方根)是最常用的精確度計量方法。如果許多數據點都靠近平均值,那么標準偏差就小;如果許多數據點都遠離平均值,則標準偏差就大。實際上,足夠多重復次數產生的數據組會形成大致的正態分布。這經常可通過經典的中心極限理論來證明,獨立同分布隨機變量在無限多時趨向于正態分布。如果PCR反應效率是100%,那么2倍稀釋點之間的平均Ct間隔應該恰為1個Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度,標準偏差就必須小于等于0.167。標準偏差越大,分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋,標準偏差必須小于等于0.250。

  Ø 靈敏度:無論CT絕對值是多少,任何能夠有效擴增和檢測起始模板拷貝數為1的系統都達到了靈敏度的極限。PCR效率是決定反應靈敏度的關鍵因素。在檢測極低拷貝數時的另一個重要的考慮因素是,低拷貝時的模板數量不能按普通情況來預期。相反,它會遵循泊松分布,即進行大量的平行重復,平均應該含有一個拷貝的起始模板,實際上約37%不含有拷貝,僅有約37%含有1個拷貝,約18%實際上含有兩個拷貝。因此,為了更可靠地檢測低拷貝,必須做大量的平行重復實驗來提供統計顯著性,并克服泊松分布的限制。

評價熒光PCR結果的標準

  除了這些因素,還必須評估和驗證合適的實驗對照(如無模板對照,無反轉錄酶對照等)以及模板質量。

  3. Real-time qPCR定量方法

  可以分為絕對定量和相對定量。絕對定量是用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線,在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較,從而得到目的基因的量。該標準品可以是純化的質粒DNA,體外轉錄的RNA,或者是體外合成的ssDNA。相對定量可以分為比較Ct法和其他一些相對方法。比較Ct指的是通過與內參基因Ct值之間的相差來計算基因表達差異,也稱之是 2-DDCt 。

  3.1絕對定量

  從標準曲線獲得線性方程:

  Y=-3.432X+34.638;R2= 0.995, E=95%,所以可以進行數據分析。

  如果未知樣品的 Ct=25,

  代入方程: 25=-3.432X+34.638,

  所以: X=2.8

  Copies=10^2.8

  3.2 2-DDCt定量

  2-DDCt方法使用的前提是內參和目的基因的擴增效率接近100%,且相差不超過5%。所用公式如下:

  2-DDCt=2-[(Ct目的基因-Ct內參基因)]處理組-[(Ct目的基因-Ct內參基因)]對照組

  =2-[E-F]處理組-[A-B]對照組=2(F-B)-(E-A)

  比如Cdk5在處理前和處理后樣品中的Ct平均值是25和22.1;內參GAPDH在處理前和處理后樣品中的Ct平均值是18.2和18.3.那么處理所致倍數變化(fold change)應該是

  =2-[(22.1-18.3)]處理組-[(25-Ct18.2)]對照組=23=8

  也就是處理造成Cdk5表達增加了7倍。

  如果是目的基因和內參基因的擴增效率相差比較大,可以用擴增效率進行校正,也就是Pfaffl方法。所用公式如下:

  處理所致倍數變化(fold change)= C(A-E)/D(F-B)

  擴增效率(E)=10-1/斜率 (理想的PCR擴增效率=2)

  百分比表示為:e%=(E-1)×100%

  同時是上面例子,如果Cdk5的擴增效率是70%;GAPDH的擴增效率是95%,那么處理所致的倍數變化(fold change)應該是

  =(1.7)(25-22.1)/(1.95)(18.3-18.2)

  =4.36

  即處理造成Cdk5表達量增加了3.36倍。

  3.3 其他定量方法

  參看文獻Marisa L. Wong and Juan F. Medrano: BioTechniques July 2005

  六、Real-Time qPCR常見問題分析

  1. 無Ct值出現

  Ø 檢測熒光信號的步驟有誤: 一般SG法采用72℃延伸時采集,Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。

  Ø 引物或探針降解: 可通過PAGE電泳檢測其完整性。

  Ø 模板量不足: 對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

  Ø 模板降解: 避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。

  2. Ct值出現過晚(Ct>38)

  Ø 擴增效率低: 反應條件不夠優化。設計更好的引物或探針;改用三步法進行反應;適當降低退火溫度;增加鎂離子濃度等。

  Ø PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足。

  Ø PCR產物太長: 一般采用80-150bp的產物長度。

  3. 標準曲線線性關系不佳

  Ø 加樣存在誤差: 使得標準品不呈梯度。

  Ø 標準品出現降解: 應避免標準品反復凍融,或重新制備并稀釋標準品。

  Ø 引物或探針不佳: 重新設計更好的引物和探針

  模板中存在抑制物,或模板濃度過高

  4. 負對照有信號

  Ø 引物設計不夠優化:應避免引物二聚體和發夾結構的出現。

  Ø 引物濃度不佳:適當降低引物的濃度,并注意上下游引物的濃度配比。

  Ø 鎂離子濃度過高:適當降低鎂離子濃度,或選擇更合適的mix試劑盒。

  Ø 模板有基因組的污染:RNA提取過程中避免基因組DNA的引入,或通過引物設計避免非特異擴增。

  5. 溶解曲線不止一個主峰

  Ø 引物設計不夠優化:應避免引物二聚體和發夾結構的出現。

  Ø 引物濃度不佳:適當降低引物的濃度,并注意上下游引物的濃度配比。

  Ø 鎂離子濃度過高:適當降低鎂離子濃度,或選擇更合適的mix試劑盒。

  Ø 模板有基因組的污染:RNA提取過程中避免基因組DNA的引入,或通過引物設計避免非特異擴增。

  6. 擴增效率低

  Ø 反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

  Ø 反應條件不夠優化:可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。

  Ø 反應體系中有PCR反應抑制物:一般是加入模板時所引入,應先把模板適度稀釋,再加入反應體系中,減少抑制物的影響。

  7. 同一試劑在不同儀器上產生不同的曲線,如何判斷?

  判斷標準:擴增效率,靈敏度,特異性

  如果擴增效率在90%-110%,都是特異性擴增,都可以把數據用于分析。

  8. 擴增曲線的異常?比如“S”型曲線?

  Ø 參比染料設定不正確(MasterMix不加參比染料時,選NONE)

  Ø 模板的濃度太高或者降解

  Ø 熒光染料的降解

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