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第八節 其它鏈擴增技術及應用范圍

  一、免疫PCR

  所謂免疫(Immune PCR)就是利用抗體與DNA特異結合來檢測抗原,把抗原抗體反應與PCR聯合應用而建立的一種抗原檢測系統。

  在免疫PCR中,一個中介分子同時具有與DNA、抗體分子特異結合的能力。其一端連接DNA(標記物),另一端連接抗原-抗體復合物,形成一個特殊的抗原-抗體-DNA連接物。作為標記物的DNA分子可用PCR的擴增,存在特異的PCR產物應證明作為標記物的DNA分子已特異地與抗原-抗體復合物結合,而且表明了抗原的存在。有人采用SAP(streptavidin – protein A)嵌合體作為中介物。它具有雙特異性結合能力,一端為鏈霉親和素,可結合生物素;另一端為可與IgG的Fc段結合的蛋白A。這樣可特異地把生物素化的DNA分子和抗原-抗體復合物連接在一起。

  選用BSA作抗原進行免疫PCR實驗,結果表明,可檢測出580個抗原分子(9.6×10-22mol/L),而且可以完全避免其它非特異信號的干擾。與采用堿性磷酸酶的ELISA相比,其靈敏度可提高105倍,較常規的放名分析靈敏度也高出幾個數量級。

  免疫PCR產物在普通的瓊脂糖電泳上就可以檢測出來,如用更好的方法來檢測PCR產物,如放射性同位素,熒光物或酶等摻入到PCR產物中,可進一步提高其靈敏度和適用性。另外,如果采用不同大小標準的DNA進行標記,在電泳時,可同時檢測出多種不同的抗原分子。

  PCR產物的多少與抗原結合量有關,如果用標準反應作對照,則可以對抗原的量進行估算。因此,通過改變連接物的濃度就可以改變檢測系統的靈敏性。其它因素,如抗體的濃度,PCR循環周期數,PCR產物的檢測方法等也同樣影響系統的靈敏性。

  二、轉錄依賴的擴增系統(Transcription-based Amplification System , TAS)

  擴增樣本中的RNA,一般要先將其逆轉錄成cDNA,再以cDNA為模板進行PCR擴增,能否將RNA靶序列直接擴增出來呢?Kwok等人發明了TAS來解決這一問題。結合應用葡聚糖珠寡核苷酸雜交技術可進一步提高方法的特異性和效率。其原理是:制備引物A、B,引物A與待檢RNA3’端互補,并有一T7RNA多聚酶的識別結合位點。逆轉錄酶以A為起點合成cDNA;引物B與此cDNA3’端互補,逆轉錄酶同時還具有RnaseH和DNA多聚酶的活性,又可利用引物B合成cDNA的第二鏈。RNA多聚酶以此雙鏈cDNA為模板轉錄出與待檢RN-一樣的RNA,這些RNA又進入下輪循環。RNA多聚酶從一個模板可以轉錄出10~103個拷貝,因此反應中待檢RNA拷貝數以10的指數方式增加,較PCR高得多。擴增產物用葡聚糖珠夾心雜交法檢測:產物先與標記的探針雜交,再與包被在葡聚糖珠上的另一互補寡核苷酸(與標記探針互補的位置不同)雜交、檢測。該方法同一般雜交檢測技術相比,特異性要高出許多。

  TAS主要特點是擴增效率極高,由于拷貝數是以10指數遞增,只有6個循環,靶序列即能達到2×106個拷貝。由此而來的另一個特點是特異性很高,在一般的RNa PCR擴增中,由于逆轉錄酶和Taq多聚酶均無較對活性,要發生錯摻,循環次數越多,錯摻率越高。TAS僅需循環4~6次,將錯摻率降低了4/5。用葡聚糖珠夾心雜交法,又進一步提高了特異性。目前認為TAS是擴增RNA的首選方法。

  三、再生式序列復制技術(3SR)

  這一反應依賴于AMV逆轉錄酶、RnaseH和T7RNA多聚酶的共同作用。當逆轉錄酶合成cDNA第一鏈后,RnaseH降解模板RNA,逆轉錄酶合成cDNA第二鏈,T7RNA多聚酶以此cDNA為模板,轉錄出與樣本RNA序列相同的RNA。其RNA擴增過程與TAS相同。由于所使用的工具酶工作的適宜溫度是37℃,所以只要在第一步變性、復性后,整個反應過程不再需要溫度循環。具體方法如下:制備引物A、B,引物A有T7RNA多聚酶識別、結合位點。將引物、樣本加入擴增緩沖液中,65℃,1min,降溫至37℃,加入人工具酶,37℃保溫1h,冰浴中止反應。可用葡聚糖夾心法檢測擴增產物。

  這一方法有幾點值得注意:(1)反應是在37℃恒溫中進行的;(2)產物中有RNA,反義RNA的cDNA,RNA的拷貝數高于Cdna(90:1);(3)效率高于PCR。使拷貝數擴增到105,PCR要85min,3SR僅要15min;(4)逆轉錄酶也具有RnaseH活性,反應又是在37℃中進行,因此推測某些病毒,如HIV-1感染的細胞內可能存在類似3SR的病毒基因擴增機制。

  四、連接酶鏈式反應(Ligase Chain Reaction,LCR)

  該技術是Landegren等人于1988年為檢出序列中點突變而設計、發明的。合成一對引物A、B,它們完成覆蓋了靶序列。經退火與靶序列結合后,A、B間留下一個缺口(nick),加入連接酶封閉缺品,兩引物成靶序列完整的互補鏈。如果靶序列中有點突變,引物不能與靶序列精確結合,缺口附近核苷酸的空間結構發生變化,連接反應不能進行,變性后引物仍是兩個。Lan-degren用生物素標記引物A,用32P標記引物B。用親和素包被的瓊脂糖珠與連接產物反應,檢測其放射性。顯然,當靶序列中存在點突變時,檢測結果是陰性的。用這種方式,Landegren將人β-珠蛋白βA、βC、βS三個等位基因區別開來。Wu等人又引入PCR的原理,在連接反應后,變性、退火、再連接,少量的靶序列就被擴增出來。Barany于1991年報道了耐熱連接酶-Taq連接酶的發現及其在LCR中的應用,為LCR的實用化奠定了基礎。實際操作時引物為4個,A、A、 A’和B、B’,分別與靶序列的正負鏈互補。每次連接反應的產物又可在下一輪反應中當模板,靶序列以指數形式擴增出來。用上面提到的標記檢測方法,即可檢測靶序列中有無點突變。

  LCR的特異性首先取決于引物與模板的特異結合,其次Taq連接酶作用的特異性,即Taq連接酶是否僅連接與靶序列完全互補的引物。實驗表明Taq連接酶的非特異活性是較低的(<1%)。控制模板、酶的濃度,使反應在接近Taq酶的溫度下進行,還可進一步降低非特異連接率。Barany用這一技術,將極少量(<200個分子)的βA、βC和βS區別開來。

  LCR的擴增效率與PCR相當。由于有很高的信噪比,其敏感性也很高。用Taq連接酶做LCR只在兩個保溫點的循環(94℃、1min和65℃、4min)。產物檢測也非常方便、敏感。因此可以說LCR是目前檢測已知序列中有無點突變的最佳方法。

  五、PCR-SSCP分析技術

  近幾年來,在PCR基礎上完善和發展起來的多種基因變異檢測方法是基因分析和檢測的一次技術革命。其中日本學者創建的PCR-SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism anal-ysis of PCR products)格外重要。它是指單鏈DNA分子在變性PAGE中電泳遷移率隨其構象的改變而改變的性質。單鏈DNA分子的構象改變即可由DNA多態性引起,又可由基因突變引起。為此,有的學者試圖用PCR-SSGE(Single-Strand Gel Electrophoresis of PCR products)代替原命名。

  PCR-SSCP分析包括PCR擴增和單鏈產物電泳兩個階段。對于分析小于400bp的PCR產物十分有效,對于大于400bp的PCR產物需處理后再分析,必須注意的是PCR-SSCP分析不能確定基因變異部位和內容,泳動后必須進一步完成DNA測序。

  六、結語

  PCR技術以驚人的速度在研究與診斷領域得到應用,限于篇幅所限,在此不一一進行討論了。本章 重點討論了PCR技術發展的有關內容,尤為影響PCR的主要因素和PCR的各種反應模式及新進展,以求大家在實際工作中能夠注意到這些問題,并有所創新,相信由于PCR自身高敏感性及實用性,在分子生物學研究與醫學實踐中PCR技術將越來越受到人們的重視。無論從哪一個角度,PCR技術從分子水平對許多傳染病、遺傳性疾病和腫瘤進行診斷,使法醫鑒定、生物進化的研究更為簡便和強化,在遺傳學、分子生物學、生物工程與醫學研究中都占有重要的地位。

  PCR技術是以生物體內DNA復制為基礎理論的,這一技術把基礎理論與應用有機結合起來,給我們以辯證的思考。對于其它學科中有關理論與實踐結合的問題具有指導意義。PCR技術必將為我們提供大量有關核酸的知識,豐富我們的理論,改變我們以前的認識,推動學科的向前發展。

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