<var id="rxbh1"></var>
<cite id="rxbh1"><video id="rxbh1"></video></cite>
<listing id="rxbh1"></listing>
<var id="rxbh1"><video id="rxbh1"><listing id="rxbh1"></listing></video></var>
<var id="rxbh1"></var><var id="rxbh1"></var>
<var id="rxbh1"></var>
<cite id="rxbh1"><span id="rxbh1"><menuitem id="rxbh1"></menuitem></span></cite><var id="rxbh1"></var>
<var id="rxbh1"></var>
<del id="rxbh1"><span id="rxbh1"></span></del>
<var id="rxbh1"></var>
<var id="rxbh1"><strike id="rxbh1"><listing id="rxbh1"></listing></strike></var>
<cite id="rxbh1"><video id="rxbh1"><thead id="rxbh1"></thead></video></cite>
<cite id="rxbh1"><video id="rxbh1"></video></cite>
<var id="rxbh1"><strike id="rxbh1"></strike></var>

第七節 PCR臨床應用領域及特點

  一、PCR應用特點

  1.操作簡便目前PCR技術采用耐高溫Taq DNA聚合酶,并且在有電腦控制的DNA擴增儀中進行,使操作大為簡化,一次加入的酶即可滿足反應全過程。DNA擴增儀能自動迅速升降溫度,只需把反應所需的全部材料混勻,置入儀器內,反應便依所輸入的程序進行。

  2.省時應用TaqDNA聚合酶時,單核苷酸摻入速率較高,75~80℃時,每個酶分子每秒鐘可完成150個核苷酸的合成。PCR每一周期需數分鐘,所以,一般常取用20~30個周期能使目的DNA達數到百萬倍擴增的反應只要數小時即可完成。在基因分離、突變體構建、DNA測序等方面,PCR方法均較之常規法快速的多。例如,用常規方法建立cDNA庫或染色體DNA庫來分離基因,需花幾個月,用PCR方法只需1~2個月星期;用M13法構建突變體需1~2個月,而PCR法只用數天;PCR方法擴增的目的DNA片段可直接用作序列分析,較常用的通過克隆、培養擴增、純化制備等步驟獲得測序片段更為簡便。

  3.靈敏度高PCR產物的生成是以指數方式增加的,所以欲擴增pg量級的起始物到μg水平或放大真核細胞單拷貝基因,通過PCR方法都是不難完成的。PCR方法可用單、雙倍體細胞、一根頭發、甚至單一精子進行DNA定型。

  4.特異性強作為引物的寡核苷酸與模板結合的正確性是決定反應產物是否特異的關鍵。Taq DNA聚合酶耐高溫的性質使反應中引物與模板退火的步驟可以在較高的溫度下進行,結合的特異性大大增加,被擴增的目的片段也能保持很高的正確程度。

  5.對原始材料質量要求低由于PCR技術有較高的靈敏度和特異性,故僅含微量(pg,ng)的目的DNA的粗制品或者總RNA,就可以用做反應起始材料來獲取目的產物。部分降解的DNA材料也可以通過PCR多次反應周期,最終得到所需的全長DNA片段。

  6.有一定程度的單核苷酸錯誤摻入由于Taq DNA聚合酶缺乏3’→5’核酸外切酶活性,因而不能糾正反應中發生的錯誤的核苷酸摻入,標準條件下,其錯誤摻入率可達1.25×10-4~1×10-5。但是,這種錯誤并不意味著PCR產物一定會發生序列改變。Innis MA發現,錯誤摻入的堿基有終止鏈延伸的作用傾向,這就使得發生了的錯誤不會再擴大。

  二、PCR應用領域

  單克隆抗體技術曾使免疫學理論與實踐有了新的突破,近幾年來PCR技術使分子生物學及相關學科發生了一次方法學的革命。在不到10年的時間內,在以下幾個領域中PCR技術已具有實用價值,且其應用范圍正在不斷擴大中。

  1.遺傳病的產前診斷 用胎兒羊膜細胞,羊水或甚至母血可以檢查胎兒的性別,這在與性染色體關聯遺傳病診斷中是必要的。對于高發的遺傳病,如地中海貧血、鐮刀狀細胞貧血、凝血因子缺乏、DMD等已在臨床應用多年,為優生優育作了貢獻,對于有遺傳傾向的疾病尤其是老年性疾病,如糖尿病、高血脂癥、甚至腫瘤中的一部分,均是當前研究的重點,近期內可望有突破。

  2.致病病原體的檢測 這些外源入侵的基因,一旦闡明其部分核酸序列,就可以設計引物或探針,用PCR、PT-PCR或雜交方法來檢測,其范圍包括細菌、病毒、原蟲及寄生蟲、霉菌、立克次體、衣原體和支原體等一切微生物,PCR診斷的特點是可以選擇其基因中的保守區作通用檢測,也可以選定差異較大的基因部位作分型檢測。既可以做一病原體的專用檢測,也可以將有關病毒、細菌中不同的品種作一次多元檢測。而且檢測的靈敏度和特異性都遠高于當前的免疫學方法,所需時間也已達到臨床要求,這對于難于培養的病毒(乙肝),細菌(如結核、厭氧菌)和原蟲(如梅毒螺旋體)等來說尤為適用。

  3.癌基因的檢測和診斷 雖然對癌基因的研究大部分還屬于基礎階段,但癌變是由基因變異所導致的這一基本事實已無庸置疑,所以癌基因、抗癌基因入抗轉移基因的研究,離開分子水平的診斷手段是無法進行的,臨床上已可應用的例子有白血病殘留細胞的定量(包括慢粒和急粒),肺癌中P53及Rb等抗癌基因的失活,神經質瘤N-myc基因的激活和表達。通過原位雜交觀察特定癌基因及抗轉移基因的植入和反義寡核苷酸對強表達癌基因的阻斷均已成為近代基因治療的著眼點。

  4.DNA指紋、個體識別、親子關系鑒別及法醫物證 這一為公、檢、法部分所矚目的課題已經在某些國家取得法律認可。肌紅蛋白小衛星基因,β-珠蛋白基因、ApoB基因等的多肽性和重復次數的差異都被應用于鑒定,其靈敏度已達到一根頭發、一個細胞、一個精子取得個體特征圖譜,這一領域也已發展到骨髓或臟器移植配型及動物種系的研究中。

  5.動、植物檢疫 靈敏、特異、快速診斷檢測方法是我國進出口口岸的門衛,檢查出入國門的人員、動、植物(種畜、種籽)等是否攜帶烈性傳染病(艾滋、動物病毒、植物病毒等)病原體,食品、飼料等是否帶沙門氏菌等均需要基因診斷手段將這些病菌拒之于國門之外,是提高我國綜合國力的必要保證。

  6.高科技生物醫學領域中的應用 在轉基因動植物中檢查植入基因的存在。PCR技術尚可應用于基因拼接、測序等領域。

日本三级片在线观看