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第六節 樣品處理與注意事項

  一、樣品處理

  DNA是染色體的主要組成部分,是PCR的擴增模板。要進行PCR,研究DNA結構與功能或者用于診斷目的,首先必須從生物體內提取DNA。DNA往往以核蛋白形式存在,其分子量大(人的染色體DNA平均大小為3.0×109bp),提取DNA應盡量保持DNA完整性和純度,即在提取中盡量避免機械張力引起的DNA分子降解,又要注意雜質及蛋白的去除,防止胞內酶解DNA。因此,提取DNA的基本過程是:用Proteinase K及SDS,在EDTA存在下,裂解細胞,消化蛋白質,使核蛋白解聚及胞內DNA酶失活,然后用酚/氯仿多次提取去除蛋白質,在DNA中若混有少量RNA,可用RNase去除,最后用乙醇沉淀得到DNA。

  理論上PCR對模板DNA純度及完整性要求并不高,細胞經過熱變性使DNA釋出就可以作為模板,依賴引物的選擇性進行擴增。這對拷貝數很多的基因組,確實如此。但當待擴增的拷貝數甚少而無關細胞甚多時則擴增就不易成功,其原因是:①非希望的擴增增多,掩蓋了所需擴增的片段,使其數量減少至不能檢測到的程度。②生物樣品中的雜質會抑制PCR反應,最主要的是血液和瓊脂糖。例如在100μl反應液中加入1μl全血就可引起抑制,0.8μmol/L的血紅素也會引起明顯的抑制。對于含血液的樣品,可以用滲透壓溶解紅細胞,離心集取細胞核,洗除血紅蛋白,再用蛋白酶/表面活性劑處理的方法來解決。另一簡單的方法是煮沸之,使釋放DNA,并沉淀Hb,用上清液作PCR。

  現將PCR前處理各種標本的基本方法介紹如下:

  1.所需溶液

  (1)PBs 0.85% W/V NaCl,66mmol/L Na3PO4 pH7.0

  (2)含表面活性劑及蛋白酶K的PCR緩沖液

  50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 2.5mmol/L MgCl2

  0.1mg/ml明膠,0.45%NP40,0.45%吐溫20

  高壓滅菌,冷凍儲存。臨用前加0.6μl的10mg/ml蛋白酶K(水溶液)至100μl溶液中。

  (3)溶血緩沖液

  0.32mol/L蔗糖,10mmol/L Tris-HCl pH7.5

  5mmol/L MgCl2,1% Triton X-100

  2.提取方法

  (1)用聚蔗糖-泛影葡胺梯度法從血液或培養細胞分離的單核細胞(當PBC〈10%細胞數時用此程序)

  ①將細胞樣品用PBS稀釋至10ml,置15ml錐形離心管中;

  ②100×g離心2~5min,吸去上清;

  ③細胞再懸浮于10ml PBS中重新離心洗滌;

  ④沉淀物懸浮于溶液2中,使細胞濃度約為6×106/ml,移至1.5ml管中;

  ⑤50~60℃保溫1h;

  ⑥95℃保溫10min使蛋白酶變性;

  ⑦冷凍儲存。

  如果RBC多于細胞的10%,則用PBS洗1次(步驟1,2)后,懸浮于1ml溶液3,并轉移至1.5ml離心管中,如程序B-2離心1次,再懸浮于溶液2中按程序A-4繼續進行。

  (2)全血:此法使胞膜溶解故胞漿DNA丟失,約可得20μg DNA/0.5ml血。

  ①0.5ml全血與0.5ml溶液3共置1.5ml管中;

  ②13000×g離心20s;

  ③吸去上清,加1ml溶液3,旋渦混合使沉淀重新懸浮;

  ④重復第2,3步2次;

  ⑤13000×g離心2s,吸去上清,懸浮于0.5ml溶液2中;

  ⑥按程序A5~7步進行。

  (3)拭子

  ①用PBS預溫的試子從宮頸、陰道或陰莖采樣;

  ②拭子置入2ml PBS(含抗霉劑)于15ml離心管中,室溫可保存24h,置4℃可保存更長時間。也可用旋渦混合器振蕩使細胞加速游離;

  ③取去拭子,2000~13000×g離心5min,吸去上清;

  ④如含RBC則加1ml溶液3,轉移至1.5ml E管中,按程序B-2開始進行;

  ⑤如不含RBC則加溶液2,按程序A-4進行。

  (4)頭發

  ①拔下頭發,剪下頭發近端0.5cm段;

  ②置入0.4ml溶液2中(1.5ml管);

  ③按程序A5~7步進行,用50μl體系作PCR。

  (5)血細胞RNA用焦碳酸二乙酯(DEP)抑制RNase,NP-40溶胞但不溶核。

  ①用聚蔗糖-泛影葡胺或其它方法分離單核細胞;

  ②置2ml離心管中,加PBS至細胞中,500×g離心5min;

  ③配制(DEP)溶液用無水乙醇將DEP作9+1稀釋,再用NP-400.5%作1:999稀釋(抑制RNase);

  ④細胞沉淀中加200~400μl此溶液,旋渦混合;

  ⑤13000×g離心10s;

  ⑥上清轉移至新管中,37℃保溫20min,90℃,10min;

  ⑦離心,上清轉移至新管。取5~10μl作反轉錄;

  ⑧如果反轉錄失敗,可能因DEP殘留,可將樣品再在90℃加熱5min,再做試驗;

  ⑨本法也可用于培養細胞。

  二、注意事項

  PCR只需幾個DNA分子作模板就可大量擴增,應注意防止反應體系被痕量DNA模板污染和交叉污染,這是造成假陽性最大的可能。下例可形象說明污染的嚴重性。

  典型的PCR反應可在100μl反應液中擴增1012個DNA,此液傾入50nm×25m×2m的游泳池中,充分混合取0.1ml池水,其中含有40個分子的DNA,用PCR擴增即已可呈陽性,這一點對檢測HIV更為重要。常規只要15個拷貝的核酸即可查出。假陽性結果往往來自痕量污染和交叉污染,尤其在待擴增靶序列濃度低的情況下,更有必要采取防備措施。

  (1)DNA處理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上,所有緩沖液吸頭、離心管等用前必須高壓處理,常規消耗用品用后作一次性處理,避免反復使用造成污染。

  (2)PCR在超凈臺內進行,操作前后紫外燈消毒。

  超凈臺內設內供PCR用微量離心機、一次性手套、整套移液器和其它必須品;移液品用一次性吸頭和活塞的正向排液器,防止移液器基部污染。

  (3)PCR操作應戴手套并勤于更換。

  (4)成套試劑,小量分裝,專一保存,防止它用。配制試劑用新器具,用后作一次性處理。

  (5)試劑管用前先瞬時離心(10s),使液體沉于管底,減少污染手套與加樣器機會。

  (6)最后加模板DNA(包括在石蠟油后),馬上蓋好,混勻,瞬時離心(10s),使水相與有機相分開。加入模板且忌噴霧污染,所有非即用管都應蓋嚴。加模板DNA后應更換手套。

  (7)實驗設陽性、陰性對照。

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