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第五節 PCR各處應用模式

  一、兼并引物(Degenerate Primer)PCR

  密碼子具有兼并性,如表22-4,單以氨基酸順序推測編碼的DNA序列是不精確的,但可以設計成對兼并引物,擴增所有編碼已知順序的核酸序列。用兼并引物時寡核苷酸中核苷酸序列可以改變,但核苷酸的數量應相同。兼并度越低,產物特異性越強,設計引物時應盡量選擇兼并性小的氨基酸,并避免引物3’末端兼并,針對兼并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的擴增、克隆和序列分析。現已成功地克隆了豬尿酸氧化酶基因、糖尿病相關肽基因和哺乳動物與禽類的嗜肝病毒基因。用脫氧肌苷(deoxyinosine;DI)引物進行PCR,可以代替編碼蛋白的多種兼并密碼子中的兼并堿基,DI的特異性主要受cDNA濃度影響。

表22-4 密碼兼并性

  注:選擇使用的肽鏈最好避開有4~6個密碼子的氨基酸

  二、套式引物(Nested Primer)PCR

  用第一套引物擴增15~30個循環,再用擴增DNA片段內設定的第二套引物擴增15~30個循環,這樣可使待擴增序列得到高效擴增,而次級結構卻很少擴增。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子濾過器離心,在第二套引物加入前去除第一引物。此方法已成功地用來分析中國倉鼠卵巢細胞AS52的分子突變。AS52細胞含有單拷貝的細胞gpt(guanine phos-phribosy transferase)基因,與哺乳動物具有同源性。套式引物PCR減少了引物非特異性退火,從而增加了特異性擴增,提高了擴增效率。對環境樣品中微生物檢測和單拷貝的基因靶DNA的擴增是非常有效的。

  若將套式PCR的內外引物稍加改變,延長外引物長度(至25~30bp),同進縮短內引物長度(15~17bp),使外引物先在高溫退火溫度下做雙溫循環擴增,然后改換至三溫循環,使內引物在外引物擴增的基礎上作低溫火溫度的三溫循環直到擴增完成,這樣就可以使兩套引物一次同時加入,兩種循環一氣呵成,等于只做一次PCR,而靈敏度與套式二次PCR無異,在我們最近推出的PTc 51氣流式DNA熱循環儀上就可以完成全部程序。

  套式一次PCR的成功,使PCR檢測的全過程可以在5h內完成,使當天出檢驗報告成為現實,也使PCR檢測走入臨床有了現實的基礎。

  三、復合PCR(Multiplex PCR)

  用多對引物同時擴增幾條DNA片段的方法稱為復合PCR。這一方法最初是由Chanberlain 等檢測人的基因發展而來。Bej等隨之發展了對環境樣品中不同屬細菌相關基因序列同時PCR擴增的檢測方法。兩種不同的軍團菌(legionella)基因,一為特異嗜肺L基因(mip),另一種為L-5SrRNA基因,通過引物搖擺(staggered)添加進行復合PCR。首先mip引物PCR擴增7個循環,然后加入5SrRNA引物PCR擴增38個循環。加入不同量的LacZ和LacB基因引物進行PCR擴增可以檢測大腸桿菌和與人類糞便污染有關的細菌包括E.coli大腸菌、腸源致病沙門氏菌和志賀氏菌。

  在復合PCR中,所有引物Ta值應相近。如果兩對引物Tq值差異超過±℃10%,會使擴增產物的量明顯不同,其中一種擴增產物或目的DNA很難觀察到。另外,靶DNA的長度也應相近,差別大時短片的靶DNA會優先擴增,因此,會產生不同產量的擴增產物,為此,須采用DNA搖擺擴增或加入不等量的引物方法進行解決。

  四、反向PCR(Inverse PCR或Reverse PCR)

  反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側的DNA,也就是說這一反應體系不是在一對引物之間而是在引物外側合成DNA(見圖22-2)。反向PCR可用于研究與已知DNA區段相連接的未知染色體序列,因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引物雖然與核心DNA區兩末端序列互補,但兩引物3’端是相互反向的。擴增前先用限制性內切酶酶切樣品DNA,然后用DNA連接酶連接成一個環狀DNA分子,通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段;現已制備了酵母人工染色體(YAC)大的線狀DNA片段的雜交探針,這對于轉座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。

  該方法的不足是:①需要從許多酶中選擇限制酶,或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。②大多數有核基因組含有大量中度和高度重復序列,而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列,這樣,通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。

  利用反向PCR可對未知序列擴增后進行分析,探索鄰接已知DNA片段的序列,并可將僅知部分序列的全長cDNA進行分子克隆,建立全長的DNA探針。適用于基因游走、轉位因子和已知序列DNA旁側病毒整合位點分析等研究。

  

圖22-2 反向PCR原理示意圖

波浪線代表靶DNA,方塊代表測翼序列,▲和△代表限制酶切位點,寡核苷酸引物與模板互補處標有平箭頭

  五、不對稱PCR(Asymmetric PCR)

  不對稱PCR的基本原理是采用不等量的一對引物產生大量的單鏈DNA(ss-DNA)。這兩種引物分別稱為限制性引物與非限制性引物;其最佳比例一般為1:50~1:100,關鍵是限制引物的絕對量。限制性引物太多太少,均不利于制備ss-DNA。也可用普通PCR制備靶DNA雙鏈DNA(ds-DNA),再以ds-DNA為模板,只用其中一種過量引物進行單引物PCR制備ss-DNA。

  產生的ds-DNA與ss-DNA由于分子量不同可以在電泳中分開,而得到純ss-DNA。

  不對稱PCR主要為測序制備ss-DNA,尤為用cD-NA經不對稱PCR進行DNA序列分析是研究真核DNA外顯子的好方法。

  六、標記PCR(LP-PCR)和彩色PCR

  LP-PCR(Labelled Primers PCR)是利用同位素、熒光素等對PCR引物5’端進行標記,據此檢測目的基因的存在與否,與常規PCR相比更為直觀,省去了限制性內切酶酶切及分子雜交等繁瑣步驟,而且一次可以同時分析多種基因成分,因而特別適合于大量臨床標本的基因診斷。目前該方法只對PCR產物進行定性鑒定。

  彩色PCR(Color complement assay)直譯為“著色互補性檢測”,是LP-PCR的一種,彩色PCR意譯更為明確:它用熒光染料標記引物的5’端。熒光染料JOE和FAM呈綠色熒光;TAMRA呈紅色熒光;COUM呈藍色熒光。不同熒光標記的引物同時參加反應,擴增后的目的基因會分別帶有引物5’端的染料,通過電泳或離心沉淀,肉眼就可以根據不同熒光的色澤判斷目標基因是否存在及擴增基因的類型。通常僅需2種不同顏色的引物,一種作為基因檢測引物;另一種作為控制條件的內對照,即可診斷基因缺失、染色體易位或感染某種病毒。檢測多種點突變時,可用更多的色彩,如多點突變的遺傳病、幾種可疑病毒感染、HLA位點分析都可以用彩色PCR同時檢測多個位點。

  七、加端PCR

  加端PCR(add-PCR)是使擴增產物的5’-末端加一段DNA順序的PCR。設計加端PCR的引物時,除與模板配對的那一部分外再加上若干堿基,這樣使擴增產物的末端加上額外一段DNA,如加上一個限制酶的識別順序或特定功能的DNA片段。Stoflet等報道在結構基因前加上噬菌體T7的啟動子,當然也可用于DNA片段的末端標記或引入特定的點突變。末端可加堿基的數量與引物的長短有關,當引物足夠長時擴增產物或末端甚至可以加上十幾個到幾十個堿基。

  八、錨定PCR或固定PCR

  錨定PCR(Anchored PCR, A-PCR)主要用于分析具有可變末端的DNA序列,Loh等用A-PCR對人外周血淋巴細胞T細胞受體α-鏈的mRNA的多變性進行了分析。先合成cDNA,并用末端脫氧核苷酸轉移酶在其3’-可變區末端加上一個PolyG尾巴。Loh等恒定區與可變區連接部位設一個引物,另一個引物是一個具5’-polyG尾巴的引物。帶有PolyG尾巴的引物是一個固定點,它可以并與PolyG尾巴結合,無論其余部分序列如何,只識別片段末端,利用此法可從前述mRNA中檢出至少20種不同序列,每一種都是獨特的,表明A-PCR不對任何特殊序列有傾向性結果,可用于T細胞、腫瘤及其它部位抗體基因的研究。

  九、玻片PCR

  在聚丙烯管中可以對多種含膜板材料進行PCR,而在顯微玻片上用組織細胞涂片或切片直接進行DNA擴增的方法就稱為玻片PCR(Slide-PCR)。

圖22-3 錨定PCR原理示意圖

  先將細胞涂片或呈單層細胞,然后用甲醇/醋酸(3:1,V/V)、Carnoy溶液、無水乙醇或4%多聚甲醛溶液固定5~15min。用蒸餾水沖洗,干燥,直接使用或保存于-20℃備用。在玻片上劃20mm×28mm為免疫組化反應區。加入30μl PCR反應混合液,其中含10mmol/L Tris pH8.3,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2,200μmol/l dNTPs,100nmol/L引物,0.01%(V/V)明膠,0.2% BSA, 2.5u/100μl Taq酶。然后蓋上22mm×40mm的蓋玻片,邊緣用石蠟油封好。把玻片放入PCR熱循環儀金屬塊上,使金屬塊與樣品呈最大程度接觸,同在聚丙烯管中一樣,進行30~40個循環。對于較短的擴增片段在后期循環中變性溫度可降低。反應后,將致冷玻片放在氯仿中除去大部分石蠟油,但不取出蓋玻片,用一個尖鑷子輕輕拈起蓋玻片一角,在相對的一角中PCR反應混合液呈半月形液面,用移液器回收。一般可回收25μl混合液,將反應產物進行瓊脂糖電泳或用套式PCR引物按標準PCR進行重新擴增。片上擴增物可做原位雜交顯示。

  在Slide-PCR中,需0.1%~1%的BSA。加入BSA可以保證擴增結果,但效率不一定很高。明膠(至少0.0001%),對擴增1kb左右的靶DNA十分重要。但對小片段擴增結果影響不大。不同的樣品提取方法或固定法對Slide-PCR都可行。

  Silde-PCR的機理可能是在起始變性過程中一部分DNA從細胞中洗提出來,然后在細胞和玻片的水相中進行PCR。用地高辛標記的人全基因組DNA探針雜交表明在起始循環中DNA極微量,而30個循環后很豐富。常規細胞染色表明只有少量的形態改變。

  Silde-PCR對于玻片上的細胞樣品提供了一種較好的方法,而不必再把這些樣品從玻片上括下來,使操作簡便,污染減少。本方法對于原樣品量極微且需病史追蹤保存的(如子宮頸涂片或涂片)具有實用價值。

  十、反轉錄PCR方法檢測RNA

  RNA的多聚酶鏈式反應(RT-PCR)是以RNA為模板,聯合逆轉錄反應(reverse transcrip-tion, RT)與PCR,可用于檢測單個細胞或少數細胞中少于10個拷貝的特異DNA,為RNA病毒檢測提供了方便;并為獲得與擴增特定的RNA互補的cDNA提供了一條極為有利和有效的途徑。

  RNA擴增包括兩個步驟:①在單引物的介導下和逆轉錄酶的催化下,合成RNA的互補鏈cDNA;②加熱后cDNA與RNA鏈解離,然后與另一引物退火,并由DNA聚合酶催化引物延伸生成雙鏈靶DNA,最后擴增靶DNA。

  在RT-PCR中關鍵步驟是RNA的逆轉錄,cDNA的PCR與一般PCR條件一樣。由于引物的高度選擇性,細胞總RNA無需進行分級分離,即可直接用于RNA的PCR。但RT-PCR對RNA制品的要求極為嚴格,作為模板的RNA分子必須是完整的,并且不含DNA、蛋白質和其它雜質。RNA中即使含有極微量的DNA,經擴增后也會出現非特異性擴增;蛋白質未除凈,與RNA結合后會影響逆轉錄和PCR;殘存的RNase極易將膜板RNA降解掉。硫氰酸胍(GaSCN)-CsCl法或酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法可提得理想的RNA制品,尤以后者方法為佳,適合一般實驗室進行。

  常用的逆轉錄酶有兩種,即禽類成髓細胞性白血病病毒(Avian myeloblastosis virus, AMV)和莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus, MO-MLV)的逆轉錄酶(RT)。一般情況下用Mo-MLV-RT較多,但模板RNA的二級結構嚴重影響逆轉錄時,可改用AMV-RT,因后者最適溫度為72℃,高于Mo-MLV-RT的最適溫度(37℃),而較高的反應溫度有助于消除RNA的二級結構。

  一步法擴增(one step amplification)是為了檢測低豐度mRNA的表達,利用同一種緩沖液,在同一體系中加入逆轉錄酶、引物、Taq酶、4種dNTP直接進行mRNA反轉錄與PCR擴增。發現Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用,而且具有反轉錄酶活性,可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進行反轉錄和其后的PCR擴增,從而使mRNA的PCR步驟更為簡化,所需樣品量減少到最低限度,臨床小樣品的檢測非常有利。用一步法擴增可檢測出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA。該法還可用于低豐度mRNA的cDNA文庫的構建及特異cD-NA的克隆,并有可能與Taq酶的測序技術相組合,使得自動反轉錄、基因擴增與基因轉錄產物的測序在一個試管中進行。

  最近Cetus公司推出rTth逆轉錄酶,兼具有DNA多聚酶的活性,對于RNA的發展起了很大的推動作用。有關rTth逆轉錄酶法參考第四節 有關內容。

  十一、定量PCR

  1.DNA-PCR定量用同位素標記的探針與電泳分離后的PCR擴增產物進行雜交,根據放射自顯影后底片曝光強弱可以對模板DNA進行定量。Abbot等利用這種方法對人類T細胞白血病反轉錄基因進行了定量研究。

  PCR擴增產物用專為檢測ds-DNA而設計的微量熒光計定量,利用染料H33258專與雙鏈DNA結合而使熒光增強50倍的特性。可以從標準模板系列稀釋擴增產物量曲線上讀出樣品中模板DNA的量或拷貝數,達到PCR定量的目的。

  利用倍比稀釋模板作系列稀釋PCR,求出最低(PCR-EB)檢測限來比較,也是常用的半定量PCR方法。

  2.mRNA-PCR定量由于MRNA-PCR定量需經兩個酶(RT和Taq)催化,因而影響因素較多。1989年Wang等報道了低豐度mRNA絕對定量方法。利用濃度已知且與待測靶mR-NA序列相同的內對照mRNA(其片段長短不同,便于PCR擴增后產物的分離),在同一體系中,用相同的由32P標記的引物與待測mRNA一同進行逆轉錄和PCR擴增,擴增產物電泳后,分別測定二者產物放射性強度,由預先制備的標準曲線推算出每個樣本特異mRNA的量。Gilliland等的結果表明,在1ng總RNA中可以對小于1pg的特異mRNA進行定量。這一定量方法在腫瘤、代謝失調、基因表達調控等研究中均有重要意義。

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