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第三節 PCR操作范例及反應體系的組成

  一、PCR操作范例

  在一個典型的PCR反應體系中需加入:適宜的緩沖液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐熱性多聚酶、Mg2+和兩個合成的DNA引物。模板DNa 94℃變性1min,引物與模板40~60℃退火1min,72℃延伸2min。在首次循環前模板預變性3~5min;在末次循環后,樣品仍需繼續延伸3~5min以上,確保擴增的DNA為雙鏈DNA。為便于了解PCR反應中各成份的組成,加入量和反應條件,使人們以此為基礎,對不同的研究對象逐項改變來找到最佳反應條件,特列舉Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA試劑盒提供的典型反應條件供參考。

表22-1 PCR反應混合液

  擴增條件:94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25~30個循環。

  注:[1]反應緩沖液[10×]含:100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),

  15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2,

  0.01%(W/V)明膠(Sigma G2500)

  [2]酶儲存緩沖液(-20℃)含:50%甘油,100mmol/l KCl,

  20mmol/L Tris-HCl ph8.0

  0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT

  200μg/ml明膠

  0.5%吐溫20,0.5% Nonidet P40

  [3][4]引物,1,2:擴增λ-噬菌體基因中500bp的片段

  引物1序列:7131~7155(5’)-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)

  引物2序列:7606~7630(5’)-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)

  注意(3’)端有2個bp互補故易生成50bp的雙體

  二、PCR反應系統的組成

  (一)PCR緩沖液(PCr Buffer)

  用于PCR的標準緩沖液見PCR操作范例。于72℃時,反應體系的pH值將下降1個單位,接近于7.2。二價陽離子的存在至關重要,影響PCR的特異性和產量。實驗表明,Mg2+優于Mn2+,而Ca2+無任何作用。

  1.Mg2+濃度Mg2+的最佳濃度為1.5mmol/L(當各種dNTP濃度為200mmol/L時),但并非對任何一種模板與引物的結合都是最佳的。首次使用靶序列和引物結合時,都要把Mg2+濃度調到最佳,其濃度變化范圍為1~10mmol/L。Mg2+過量易生成非特異性擴增產物,Mg2+不足易使產量降低。

  樣品中存在的較高濃度的螯合劑如EDTA或高濃度帶負電荷的離子基團如磷酸根,會與Mg2+結合而降低Mg2+有效濃度。因此,用作模板的DNA應溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。

  dNTP含有磷酸根,其濃度變化將影響Mg2+的有效濃度。標準反應體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L,低于1.5mmol/L的Mg2+濃度。因此,在高濃度DNA及dNTP條件時,必須相應調整Mg2+的濃度。

  2.Tris -HCl緩沖液在PCR中使用10~50mmol/L的Tris –HCl緩沖液,很少使用其他類型的緩沖液。Tris緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液,pKa為8.3(20℃),△pKa為0.021/℃。因此,20mmol/l Tris pH8.3(20℃)時,在典型的熱循環條件下,真正的pH值在7.8~6.8之間。

  3.KCl濃度K+濃度在50mmol/L 時能促進引物退火。但現在的研究表明,NaCl濃度在50mmol/L時,KCl濃度高于50mmol/L將會抑制Taq酶的活性,少加或不加KCl對PCR結果沒有太大影響。

  4.明膠明膠和BSA或非離子型去垢劑具有穩定酶的作用。一般用量為100μg/ml,但現在的研究表明,加或不加都能得到良好和PCR結果,影響不大。

  5.二甲基亞砜(DMSO)  在使用Klenow片段進行PCR時DMSO是有用的;加入10%DM-SO有利于減少DNA的二級結構,使(G+C)%含量高的模板易于完全變性,在反應體系中加入DMSO使PCR產物直接測序更易進行,但超過10%時會抑制Taq DNA聚合酶的活性,因此,大多數并不使用DMSO。

  (二)四種脫氧三磷酸核苷酸(4×dNTPs)

  在PCR反體系中dNTP終濃度高于50mmol/L會抑制Taq酶的活性,使用低濃度dNTP可以減少在非靶位置啟動和延伸時核苷酸錯誤摻入,高濃度dNTPs易產生錯誤摻入,而濃度太低,勢必降低反應物的產量。PCR常用的濃度為50~200μmol/L,不能低于10~15μmol/L。四種dNTP的濃度應相同,其中任何一種濃度偏高或偏低,都會誘導聚合酶的錯誤摻入,降低合成速度,過早終止反應。

  決定最低dNTP濃度的因素是靶序列DNA的長度和組成,例如,在100μl反應體系中,4×dNTPs濃度若用20μmol/L,基本滿足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μg DNA,而200μmol/L足以合成25μg/DNA。

  購自廠商的dNTP溶液一般均未調pH,應用1mol/l NaOH將dNTP貯存液pH調至7.0,以保證反應的pH值不低于7.1。市購的游離核苷酸凍干粉,溶解后要用NaOH中和,再用紫外分光光度計定量。

  (三)引物的量

  引物在PCR反應中的濃度一般在0.1~1μmol/L之間。濃度過高易形成引物二聚體且產生非特異性產物。一般來說用低濃度引物經濟、特異,但濃度過低,不足以完成30個循環的擴增反應,則會降低PCR的產率。

  (四)Taq DNA聚合酶的量

  典型PCR反應混合物中,所用酶濃度為2.5U/μl,常用范圍為1~4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同,以及其它條件的差異,多聚酶的用量亦有差異,酶量過多會導致非特異產物的增加。

  由于生產廠家所用兵配方、制造條件以及活性定義不同,不同廠商供應的Taq DNA聚合酶性能也有所不同。

  Cetus公司酶定義是:1個酶單位是指在以下分析條件下,于74℃,30min內使10nmmol的dNTP摻入酸不溶性成分所需的酶。測定時間為10min,折算成30min摻入量。

  分析條件為25nmol/L TAPS(三羥基-甲基-氨基丙烷磺酸鈉pH9.3,25℃),50mmol/l KCl, 2mmol/L MgCl2,1mmol/L β-ME(巰基乙醇),dATP、dTTP、dGTP各200mmol/L,dCTP為100mmol/L(由不標記及α-32P標記混合),12.μg變性鯡魚精子DNA,最終體積50μl。

  (五)模板

  單、雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品。若起始材料是RNA,須先通過逆轉錄得到第一條cDNA。雖然PCR可以僅用極微量的樣品,甚至是來自單一細胞的DNA,但為了保證反應的特異性,還應用ng級的克隆DNA,μg水平的單拷貝染色體DNA或104拷貝的待擴增片段作為起始材料,模板可以是粗品,但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結合DNA的蛋白。

  DNA的大小并不是關鍵的因素,但當使用極高分子量的DNA(如基因組的DNA時),如用超聲處理或用切點罕見的限制酶(如Sal1和Not1)先行消化,則擴增效果更好。閉環靶序列DNA的擴增效率略低于線狀DNA,因此,用質粒作反應模板時最好先將其線狀化。

  模板靶序列的濃度因情況而異,往往非實驗人員所控制,實驗可按已知靶序列量逆減的方式(1ng,0.1ng,0.001ng等),設置一組對照反應,以檢測擴增反應的靈敏度是否符合要求。

  (六)石蠟油

  PCR擴增時建議在混合物上面鋪一層石蠟油,減少PCR過程中尤其是變性時液體蒸發所造成的產物的丟失。研究表明,應用石蠟油可使擴增產量增加5倍,可能與石蠟油維持熱恒定和整個反應體系中鹽濃度有關。

  三、電泳分析

  在實際工作中常采用瓊脂糖凝膠電泳。一般情況下先在電泳緩沖液或凝膠中加1%溴化乙錠(EB)(每100ml加100μl),然后將已經制備好的1%~2%瓊脂糖凝膠(用電泳緩沖液配制)放入電泳槽內,加入待測樣品10μl,同時用分子量標準品作標記。瓊脂糖濃度應按分離DNA片段的大小進行選擇,一般用1.5%~2%,電泳電壓75V,待樣品進行凝膠內距膠末端1cm時,切斷電源,取出凝膠在紫外燈下直接觀察結果。

  由于溴化乙錠可與雙鏈DNA形成結合物,在紫外燈下能發射熒光,使EB的熒光強度增強80~100倍,所以,電泳后凝膠在紫外燈下可直接觀察。一般肉眼觀察DNA量可達10ng,其熒光強度與DNA含量成正比。

  DNA分子在凝膠中泳動速度決定于電荷效應及分子效應。前者由所帶凈電荷量決定,而后者與分子大小及構型有關。按照DNA分子大小,其凝膠濃度可做不同的調整。有條件的實驗室也可用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析擴增的DNA片段。

表22-2 電泳檢測擴增結果,EB熒光顯色(254nm)

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