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第二節 PCR技術的原理

PCR是體外酶促合成特異DNA片段的新方法,主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復的熱循環構成:即在高溫(95℃)下,待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板;而后在低溫(37~55℃)情況下,兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合,形成部分雙鏈;在Taq酶的最適溫度(72℃)下,以引物3’端為合成的起點,以單核苷酸為原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新鏈。這樣,每一雙鏈的DNA模板,經過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復進行,每一次循環所產生的DNA均能成為下一次循環的模板,每一次循環都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區拷貝數擴增一倍,PCR產物得以2n的批數形式迅速擴增,經過25~30個循環后,理論上可使基因擴增109倍以上,實際上一般可達106~107倍。

圖22-1 PCR基本原理示意圖

假設擴增效率為“X”,循環數為“n”,則二者與擴增倍數“y”的關系式可表示為:y=(1+X)n。擴增30個循環即n=30時,若X=100%,則y=230=1073741824(>109);而若X=80%時,則y=1.830=45517159.6(>107)。由此可見,其擴增的倍數是巨大的,將擴增產物進行電泳,經溴化乙錠染色,在紫外灶照射下(254nm)一般都可見到DNA的特異擴增區帶。

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