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《腫瘤個體化治療檢測技術指南》解讀!

  為進一步提高腫瘤個體化用藥基因檢測技術的規范化水平,7月31日,國家衛生計生委個體化醫學檢測技術專家委員會,在廣泛征求意見的基礎上,制訂了《腫瘤個體化治療檢測技術指南(試行)》。

  為什么要制定《腫瘤個體化治療檢測技術指南(試行)》?

  腫瘤個體化治療以疾病靶點基因診斷信息為基礎,以循證醫學研究結果為依據,為患者提供接受正確治療方案的依據,已經成為現代醫學發展的趨勢。臨床研究證實,通過檢測腫瘤患者生物樣本中生物標志物的基因突變、基因SNP分型、基因及其蛋白表達狀態來預測藥物療效和評價預后,指導臨床個體化治療,能夠提高療效,減輕不良反應,促進醫療資源的合理利用。

  腫瘤的個體化治療基因檢測已在臨床廣泛應用,實現腫瘤個體化用藥基因檢測標準化和規范化,是一項意義重大的緊迫任務。

  《腫瘤個體化治療檢測技術指南(試行)》從診斷項目的科學性、醫學實驗室檢測方法的準入、樣本采集至檢測報告發出的檢測流程、實驗室質量保證體系四個方面展開了相關論述,使臨床醫生能夠了解所開展檢測項目的臨床目的、理解檢測結果的臨床意義及對治療的作用;醫學實驗室為患者或臨床醫護人員提供及時、準確的檢驗報告,并為其提供與報告相關的咨詢服務。檢測技術的標準化和實驗室準入及質量保證對臨床和醫學實驗室提出了具體的要求,以最大程度的保證檢測結果的準確性。

  《腫瘤個體化治療檢測技術指南(試行)》是如何修訂問世的 ?

  《腫瘤個體化治療檢測技術指南(試行)》是參考現行相關的法規和標準以及當前認知水平下制定的,隨著法規和標準的不斷完善,以及腫瘤個體化治療靶點基因的不斷發現,本技術規范相關內容也將進行適時調整。

  指南由中國醫學科學院腫瘤醫院分子腫瘤學國家重點實驗室、蘇州生物醫藥創新中心起草,經國家衛生計生委個體化醫學檢測技術專家委員會、中國抗癌協會相關專業委員會、中華醫學會檢驗醫學分會、中華醫學會腫瘤學分會的專家修訂。起草人包括詹啟敏、曾益新、王玨、姬云、錢海利、李曉燕、孫石磊。

  《腫瘤個體化治療檢測技術指南(試行)》包括什么內容?

  《腫瘤個體化治療檢測技術指南(試行)》主要內容包括腫瘤個體化治療檢測分析前、分析中和分析后質量保證規范,從而使臨床醫生能夠了解所開展檢測項目的臨床目的、理解檢測結果的臨床意義及對治療的作用,并指導臨床個體化治療,提高療效,減輕不良反應,促進醫療資源的合理利用。

  《腫瘤個體化治療檢測技術指南(試行)》適應于誰?

  指南由國家衛生計生委個體化醫學檢測技術專家委員會制定,是國家衛生計生委個體化醫學檢測指南的重要內容,旨在為臨床分子檢測實驗室進行腫瘤個體化用藥基因的檢測提供指導。本指南的主要適用對象為開展個體化醫學分子檢測的醫療機構臨床分子檢測實驗室。

  進行個體腫瘤診斷的樣本類型

  腫瘤細胞是否存在,是開展腫瘤個體化治療基因檢測的重要前提。如果要確認腫瘤細胞存在,與病理診斷醫生密切合作是非常必要的。《腫瘤個體化治療檢測技術指南(試行)》指出:鑒定個體腫瘤的樣本包括新鮮組織(包括手術和活檢組織)、石蠟包埋組織、胸腹水等細胞學樣本、血漿樣本這4種類型。

  新鮮組織(包括手術和活檢組織)

  腫瘤新鮮冷凍材料可提取出最高品質的DNA、RNA。在手術現場取樣的情況也比較多,但需要在顯微鏡下確認腫瘤細胞含量。周圍炎癥嚴重的腫瘤、黏液產生過高的腫瘤、病變中心廣泛纖維化的腫瘤細胞不能采集,以免產生假陰性結果。切割后取其中一半,并利用另一半切面制作組織標本,然后進行確認。

  手術切除的組織樣本理想的保存方法是迅速置于液氮中,然后保存于液氮罐或-80℃冰箱,這一過程應在手術樣本離體后30分鐘內完成。由于組織樣本通常需先進行病理學分析,在分析完成后應盡早將組織樣本置于穩定劑中,避免核酸降解。

  石蠟包埋組織(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)

  10%中性福爾馬林固定手術切除樣本,按病理學操作規范進行取材。制作石蠟切片時,切取5片連續切片,其中1片進行HE染色,確認腫瘤細胞的含量。在高靈敏度檢測方法中,可考慮使用活檢標本。

  DNA容易受固定的影響,長時間(1周以上)浸泡在福爾馬林中的樣本的DNA會被片段化,不能檢出突變。活檢材料的固定時間一般是24小時,對于穿刺等活檢樣本,固定時間控制在6~24小時為佳。

  胸腹水等細胞學樣本

  用胸腹水中的腫瘤細胞用于基因檢測時,必須確認腫瘤細胞,穿刺獲得胸腹水樣本提交給細胞病理檢查之后,剩余液體冷藏/冷凍保存,也可在含有細胞成分的離心沉淀中加入含有蛋白質變性劑的緩沖液(AL緩沖液,Qiagen公司)等室溫保存。由于細胞學樣本的腫瘤細胞含量較低,因此必須使用高靈敏度檢測方法。

  血漿樣本

  循環DNA(circulating free DNA,cfDNA)是存在于血漿中的游離DNA,腫瘤來源的DNA占血漿游離DNA的比例在不同腫瘤及病例中相差懸殊(0.01~93%),從而限制了外周血在腫瘤分子檢測時的應用。目前已有多篇文獻證實可利用從血漿游離DNA檢出突變,但需要使用ARMS法等靈敏度非常高的檢測方法。

  采集外周血提取血漿游離DNA進行檢測,取樣時應使用一次性密閉EDTA抗凝真空采血管,采集6~10ml全血,冷藏運輸,6小時內分離血漿,提取游離DNA,保存到-80℃冰箱中,并避免反復凍融。如外周血需長時間運輸,建議用商品化的游離DNA樣本保存管,在常溫條件下,cfDNA在全血中可穩定保存7天。

  9大檢測技術,孰優孰劣?

  指南指出,腫瘤檢測實驗室按照《個體化醫學檢測質量保證指南》要求進行。在符合國家衛生計生委要求的個體化醫學檢測實驗室和通過審核驗收的臨床基因擴增檢驗實驗室完成。檢測方法包括Sanger測序法、焦磷酸測序法(Pyrosequencing)、新一代測序(NGS)、擴增阻滯突變系統(ARMS)-PCR法、高分辨率熔解曲線(HRM)法、數字PCR(Digital PCR)、熒光原位雜交(FISH)、免疫組化(IHC)、熒光定量逆轉錄PCR(Q-RT-PCR)這9種方法。

  Sanger測序法

  Sanger測序法是DNA序列分析的經典方法,最直接的、可檢測已知和未知突變的一種方法。由于該方法可直接讀取DNA的序列,因此被認為是基因分型的金標準。

  優點是測序長度較長,可發現新的變異位點,包括一些新的少見的突變形式及突變的確切類型,如點突變、片段缺失;局限性是靈敏度不高,突變等位基因需要超過20%才能檢出。對樣本中腫瘤細胞的含量和比例要求較高,一般要求腫瘤細胞含量不低于50%,如果腫瘤細胞比例低于50%,則假陰性出現的概率會顯著增加;不適用于活檢或細胞學樣本。

  焦磷酸測序法(Pyrosequencing)

  焦磷酸測序技術是一種新型的酶聯級聯測序技術,其重復性和精確性可與Sanger測序相媲美,而測序速度則大大提高,非常適合對已知的短序列進行重測序分析。

  主要優點是檢測靈敏度為10%,相對Sanger測序法高,對體細胞突變和甲基化等可實現定量檢測;分型準確可靠,通量較高,實驗設計靈活,可發現新的突變或遺傳變異;局限性是測序長度較短,不能對長片段進行分析。檢測靈敏度中等,難以檢出低于10%的突變。不適用于活檢或細胞學樣本。

  新一代測序(NGS)

  NGS又稱大規模平行測序(MPS),包含多種可以一次性產生大量數字化基因序列的測序技術,是繼Sanger測序的革命性進步,采用平行測序的理念,能夠同時對上百萬甚至數十億個DNA分子進行測序,實現了大規模、高通量測序的目標。不同廠家的產品測序原理不同,主要分為邊合成邊測序(SBS)、基于“DNA簇”和“可逆性末端終結”大規模平行測序、 4色熒光標記寡核苷酸的連續連接反應測序和半導體芯片測序。

  高通量測序技術不僅可以進行大規模基因組測序,還可用于基因表達分析、非編碼小分子RNA的鑒定、轉錄因子靶基因的篩選和DNA甲基化等相關研究。

  高通量測序技術有三大優點是傳統Sanger測序法所不具備的:第一,它利用芯片進行測序,可以在數百萬個點上同時閱讀測序;第二,高通量測序技術有定量功能,樣品中DNA被測序的次數反映了樣品中這種DNA的豐度;第三、利用傳統Sanger測序法完成的人類基因組計劃總計耗資27億美元,而現在利用高通量測序技術進行人類基因組測序,測序成本只需1千美金。

  局限性是檢測靈敏度和測序深度相關。一般來說,NGS在腫瘤體細胞突變檢測時,檢測靈敏度為10%;已知的與腫瘤相關驅動基因數量有限,疾病表型和基因型的關系還有賴于生物信息的解讀,目前NGS應用于腫瘤細胞突變檢測的標準化和質量控制尚未形成共識。

  擴增阻滯突變系統(ARMS)-PCR法

  擴增阻礙突變系統(ARMS)是PCR技術應用的發展,也稱等位基因特性PCR(AS-PCR)等,用于對已知突變基因進行檢測,是目前實驗室常用的基因突變檢測方法。

  主要優點是ARMS-PCR法檢測靈敏度高,可檢測腫瘤細胞中突變比例為1%甚至更低的突變基因;局限性是只能檢測已知的突變類型,不能發現一些新的、未知的突變;如果檢測的突變位點或類型較多,則隨著引物數目增加出現非特異性結合的概率也相應增加;當檢測位點較多時,對DNA樣本量的需求增加。

  高分辨率熔解曲線(HRM)法

  高分辨率熔解曲線(HRM)是一種基于PCR新型技術,用于檢測基因變異包括未知的基因變異、單核苷酸多態性以及基因甲基化。HRM是基于在加熱過程中雙鏈變性為單鏈的原則,其分析不受堿基突變位點和種類的限制,可用于突變掃描、基因分型、序列匹配、DNA甲基化等方面的研究。

  主要優點是檢測靈敏度1%,特異性高,重復性好;封閉體系,減少污染的可能性;擴增和檢測同時進行,無需PCR后進行處理;局限性是通過熔解曲線的圖不能判斷某一特異性的變異體,下游分析中檢測需要有測序等補充。

  數字PCR(Digital PCR)

  數字PCR是一種核酸分子絕對定量技術。相較于qPCR,數字PCR能夠直接數出DNA分子的個數,對起始樣品絕對定量,目前的應用包括稀有等位基因檢測、基因表達絕對定量、核酸標準品絕對定量、二代測序文庫絕對定量等。

  主要優點是靈敏度可達0.001~0.0001%,高特異性,可檢測復雜背景下的靶標序列;可高度耐受PCR反應抑制劑;不必依賴對照品或標準品,可對目標拷貝數直接進行精確的鑒定,分析微小的濃度差異;實驗數據分析便捷,每個微滴的檢測結果以陰性、陽性判讀,數據分析自動化;可統計突變率,通過統計分析可得出靶點的突變率。

  不足的是,數字PCR儀通量較低,目前通常能檢測的信號為FAM和HEX。一般單個反應2重反應效果最佳;數字PCR優點是靈敏度高,但是對于DNA濃度大的樣本處理就沒有優勢,而且核酸濃度高時,每個微滴里面包含的拷貝數不符合泊松分布;數字PCR雖然不依賴標準曲線,但是每次反應之間存在差異,短期內不能代替qPCR,也不能代替其他金標準而作為首選方法。QX200等數字PCR儀目前僅用于科研用途,數字PCR走向臨床檢驗還需要一段時間。

  熒光原位雜交(FISH)

  熒光原位雜交(FISH)是通過熒光標記的DNA探針與細胞核內的DNA靶序列雜交,并在熒光顯微鏡下觀察分析其結果的一種分子細胞遺傳學技術,主要可對基因缺失、基因融合、基因擴增進行檢測。

  優點是可多種熒光標記,顯示DNA片段及基因之間的相對位置與方向,空間定位精確;靈敏、特異性好,可同時分析分裂期和間期的多個細胞,并進行定量;可以檢測隱匿或微小的染色體畸變及復雜核型;缺點是FISH檢測對操作和判讀技術要求較高,診斷醫師必須經過嚴格的FISH操作和結果判讀培訓,只有經FISH操作經驗豐富的醫師判定的結果才具有可靠性;目前FISH檢測的成本昂貴、通量低。

  免疫組化(IHC)

  免疫組化(IHC)分析利用抗體和抗原之間的結合的高度特異性,借助于組織化學的方法將抗原抗體結合的部位和強度顯示出來,以其達到對組織或細胞中的相應抗原進行定性、定位或定量的研究。作為篩查工具優于FISH,具有經濟快捷的優點,尤其適用于大量樣本的檢測分析。影響IHC結果的因素主要包括抗體的選擇、檢測前組織的固定,觀察者解釋方面的差別等。

  熒光定量逆轉錄PCR(Q-RT-PCR)

  熒光定量PCR是檢測拷貝數變化的一種快速且經濟的技術方法,該方法技術可用于RNA表達水平檢測該技術主要優點是檢測快速、通量高、靈敏度好,主要不足是對腫瘤組織提取RNA的質量要求較高,在檢測基因表達量時判讀標準尚未統一。

FISH、IHC和Q-RT-PCR檢測ALK基因重排的優缺點比較

  指南指出,在檢測方法選擇策略上,實驗室應優選國際和國內“金標準”的檢測方法,同類方法中優先選擇結果穩定性、重復性好、特異性高的技術,同時也應考慮樣本量,檢測項目的多少等,綜合選擇合適的方法。由于腫瘤組織的異質性,檢測的組織樣本中混有大量正常組織、石蠟樣本提取的DNA質量和數量有限,就檢測靈敏度而言,目前ARMS-PCR>焦磷酸測序>Sanger測序。

  在檢測腫瘤基因突變時,不能一味追求檢測方法的靈敏度,靈敏度高的檢測方法對整個實驗過程中的質控要求更為嚴格,需防止因污染而產生假陽性。

  在腫瘤靶基因表達檢測時,由于腫瘤樣本的不可再生性,需謹慎選擇使用的方法,如選用熒光定量PCR要求提取的總RNA量達1µg以上,如果腫瘤組織過小,提取的RNA量可能達不到檢測要求,此時應考慮選用對樣本量要求低的檢測方法。

  此外,藥物基因組學也已成為指導臨床個體化用藥、評估嚴重藥物不良反應發生風險、指導新藥研發和評價新藥的重要工具,部分上市的新藥僅限于特定基因型的適應癥患者,為此衛計委在頒發《腫瘤個體化治療檢測技術指南(試行)》的同時,也同步頒發了制訂了《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南(試行)》。

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